PT. So Good Food Jl. Raya Solo - Boyolali

PENENTUAN TIPE MATING RAGI Saccharomyces Cerevisiae

A.  PENDAHULUAN

Beberapa kelebihan ragi diantaranya pertumbuhannya cepat, pola pertumbuhan ’budding’ sel yang tersebar, mudah untuk dilakukan replika plating, dan sistem genetik ragi telah diketahui dengan baik. Sebanyak 16 kromosom ragi S. cerevisiae yang telah terkarakterisasi, DNA kromosom ini memiliki ukuran total 12.052 kb, sedangkan masing-masing kromosom memiliki ukuran 200 kb hingga 2.200 kb. S. cerevisiae memiliki 6.183 open reading frame (ORF) dan hanya 5.773 gen mengkode protein, gen-gen ini rata-rata berukuran 1,45 kb atau 483 kodon.

Ciri lain dari ragi S. cerevisiae adalah mempunyai sel-sel berbentuk haploid dan diploid yang stabil. Beberapa perbedaan antara sel-sel haploid dan diploid dari S. cerevisiae adalah volume sel haploid 70 μm³, sel diploid 120 μm3, sel haploid memiliki komposisi DNA 0, 017 × 10−12g, RNA 1, 2 × 10−12g dan protein 6 × 10−12g, sedangkan sel diploid memiliki komposisi DNA 0, 034 × 10−12g, RNA 1, 9 × 10−12g dan protein 8×10−12g. Sebenarnya ukuran sel haploid dan diploid bervariasi sesuai dengan strain dan fase pertumbuhannya. Sel haploid berbentuk sferoid dengan diameter berukuran 4 μm, sedangkan sel diploid berbentuk elips berukuran 5×6 μm. Selama fase eksponensial pertumbuhan, kultur sel haploid cenderung untuk memiliki jumlah sel yang lebih banyak per cluster nya dibandingkan dengan sel diploid. Sel haploid memiliki budding yang muncul berbatasan sel diploid sebelumya, sedangkan sel diploid memiliki budding yang muncul pada kutub yang berlawanan.

B.  METODE PENELITIAN

1.    Strain dan kondisi kultur yang digunakan

Media agar YPAD terdiri atas yeast extract 1%, bakto pepton 2%, dextrosa 2%, bakto agar 2%, adenine 0.4 mg/ml dan air suling (Sigma- Aldrich Co). Media minimum terdiri atas yeast nitrogen base tanpa asam amino 0,67%, glukosa 2% dan bakto agar 2%. Jika tidak dijelaskan lebih lanjut pertumbuhan sel dilakukan pada temperatur 30 ⁰C.

Media SPM (sporulation medium) merupakan media sporulasi terdiri atas kalium asetat 0,3%, rafinosa 0,02%, suplemen-suplemen adenin, arginin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilalanin, treonin, triptopan, urasil dan valin masing-masing 10 μg/ml.

2.    Pembentukan aski diploid ragi S. cerevisiae dengan penyilangan

Mating dilakukan antara strain A yang memiliki tipe MATα disilangkan dengan strain B yang memiliki tipe MATa. Setelah inkubasi pada 30_C selama semalam, sel diploid di kumpulkan dan ditransfer pada media SPM sebagai media penginduksi sporulasi. Inkubasi selama 4 hari hingga 1 minggu sampai terbentuk jumlah aski yang memiliki 4 spora cukup banyak. Pisahkan spora aski dengan mikromanipulator menggunakan media YPDA. Inkubasi pada 30⁰C selama 2-3 hari. Kemudian koloni-koloni sel yang tumbuh dipindahkan ke media baru YPDA.

3.    Pengujian tipe mating terhadap koloni-koloni strain yang tumbuh menggunakan strain tester SH682 dan SH683

Sel-sel yang akan diuji tipe mating-nya digoreskan pada media YPDA. Inkubasi semalam pada suhu 30 C. Masing-masing sel strain tester SH682 untuk penentuan strain MAT dan SH683 untuk penentuan strain MATa diinokulasi dengan menggunakan 5 mL media YPDA broth yang diiinkubasi pada suhu 30 C selama semalam. Sebarkan sel-sel tester tersebut ke dalam media agar YPDA dan inkubasi pada 30 C selama semalam. Dengan cara replika silangkan sel-sel tester dan sel-sel uji ini menggunakan media YPDA agar, inkubasi pada 30 C selama semalam. Replika plating dengan media YPDA baru kemudian inkubasi pada 30 C selama semalam. Replika dengan menggunakan media minimum dan inkubasi pada 30 C selama satu hari.

C.  HASIL DAN PEMBAHASAN

Diploid sel hasil penyilangan A×B dikumpulkan dan dipindahkan ke media SPM yang miskin nutrisi sehingga diharapkan sel akan berspora dengan baik. Dengan mikromanupulator, kita dapat melakukan pemisahan askospora, zigot dan sel vegetatif. Didalam media agar SPM, dapat kita temukan aski yang terdiri 4 spora, 3 spora, 2 spora,1 spora dan juga sel vegetatif yang tidak berspora. Kami hanya mengambil sampel aski yang mengandung 4 spora dan dilakukan pemisahan spora-sporanya menggunakan media kaya YPDA. Aski yang memiliki 4 spora memiliki ciri berbentuk tetrahedral.

Pemisahan spora dilakukan pada mediaYPDA sehingga memudahkan pertumbuhan sel. Untuk memudahkan pemisahan spora-spora ini, sebelumnya menggunakan mikromanipulator, dilakukan pengrusakan dinding spora dengan penambahan enzim lisozym dan inkubasi pada suhu 30⁰C selama 5 menit. Spora-spora yang sudah terpisah diinkubasi pada 30⁰C selama 2-3 hari. Apabila hasil pemisahan setiap aski menghasilkan 4 independent koloni sel mengindikasikan bahwa pekerjaan pemisahan spora-spora aski dilakukan dengan baik.

Strain tester yang digunakan untuk menentukan tipe mating ragi S. cerevisiae adalah SH682 yaitu strain dengan tipe MATa karena sel MATa menghasilkan polipeptida feromon faktor a yang berinteraksi dengan reseptor yang ada pada permukaan sel α. Begitu juga sebaliknya SH683 merupakan strain dengan tipe MATα karena sel MATα menghasilkan polipeptida pheromon faktor α yang berinteraksi dengan reseptor yang ada pada permukaan sel a.          

DAFTAR PUSTAKA

Hermansyah. 2010. Penentuan Tipe Mating Ragi Saccharomyces Cerevisiae. Jurnal Penelitian Sains, Vol. 13. No. 1 (C) 13102. UNSRI.